La tecnología del ADN recombinante permite el aislamiento de un gen de un organismo
para introducirlo en otro. Entre sus aplicaciones se encuentra la producción
de grandes cantidades de la proteína codificada por dicho gen, como por ejemplo
proteínas humanas en cantidad suficiente para que puedan ser utilizadas como
fármacos. Las proteínas obtenidas por esta técnica se denominan proteínas recombinantes.
Antes de la tecnología del ADN recombinante también se utilizaban como medicamentos
algunas proteínas, sin embargo la manera de obtenerlas era o bien por síntesis
química, o bien mediante el aislamiento de la proteína a partir de su fuente
natural (tejido o fluido animal, humano o de plantas). No obstante, ambas técnicas
tienen sus limitaciones. La síntesis química debido a su complejidad y elevado
coste sólo es aplicable cuando la proteína de interés es muy pequeña. Por su
parte, el aislamiento de las proteínas a partir de la fuente natural a menudo
se encuentra con el problema de que el rendimiento de la extracción es muy bajo.
Por ejemplo hasta hace relativamente poco tiempo la única manera de obtener
factores de coagulación para personas hemofílicas era mediante la manipulación
de litros de sangre, y era necesario procesar cientos de hipófisis de cadáveres
humanos para sacar una pequeña cantidad de hormona del crecimiento, imprescindible
para tratar algunos problemas de enanismo. Mediante la aplicación de las técnicas
de ADN recombinante es posible solventar estos problemas y obtener proteínas
que no se podrían conseguir con los métodos tradicionales.
La tecnología de ADN recombinante se desarrolla en tres pasos: el aislamiento
del gen de interés, la clonación y expresión de dicho gen, y la producción a
gran escala de la proteína codificada por el gen. Cada uno de estos procesos
precisa de unas herramientas la mayoría de las cuales son ofrecidas por la propia
naturaleza.
El aislamiento de un gen no es fácil. Originariamente lo que se hacía era aislar
la proteína de la que se quería obtener el gen e intentar determinar por medios
químicos la secuencia de aminoácidos que la componían. Este proceso se denomina
secuenciación de proteínas y a diferencia de la secuenciación de ADN es técnicamente
muy complicado. Si la proteína es suficientemente pequeña puede ser secuenciada
en su totalidad y esta información, gracias al código genético, era utilizada
para sintetizar químicamente el gen. Para proteínas de tamaño medio o grande
lo que se hacía era secuenciar solamente una pequeña parte de la proteína y,
utilizando también el código genético, fabricar una cadena de ADN de 15 ó 20
nucleótidos que era complementaria a una de las cadenas del gen o al ARNm correspondiente.
Esta corta cadena de nucleótidos se marcaba radiactivamente o por fluorescencia
y se utilizaba como sonda para identificar el gen completo o el ARNm completo
que llevan la información para sintetizar la proteína de interés. En el caso
de que hayamos localizado el ARNm tenemos que convertirlo en ADN. Este proceso
se hace mediante la enzima llamada transcriptasa inversa. La cadena de ADN obtenida
utilizando la información de un ARNm se llama ADN complementario o abreviadamente
ADNc. Actualmente gracias a la existencia de genotecas y a la secuencia de muchos
genomas, entre ellos el humano, el aislamiento de cualquier gen es una tarea
mucho más simple.
Vectores de transferencia: Plásmidos
Los primeros experimentos destinados a conseguir producir proteínas
humanas en microorganismos fallaron porque, a pesar de que se conseguía introducir
el gen en la célula huésped que debía fabricar la proteína humana, ésta en lugar
de llevar a cabo este proceso, o bien degradaba el gen que se le había introducido,
o bien a medida que la célula se dividía, sólo una de las hijas recibía copia
del gen humano por lo que dicho gen iba diluyéndose. Estos problemas fueron
soslayados cuando se descubrió que se podían emplear unas herramientas que también
están en la naturaleza: los plásmidos y los virus. Los plásmidos son moléculas
de ADN circular que se encuentran en muchas bacterias y levaduras, y que se
caracterizan porque pueden replicarse, es decir "reproducirse", independientemente
del genoma de la célula. Muchos de ellos contienen genes de resistencia a antibióticos,
lo que permite distinguir las células que han incorporado el plásmido, y que
por consiguiente son capaces de crecer en un medio con el antibiótico, de las
demás. Por su parte, los virus son entidades que están especializadas precisamente
en insertar su material genético en células y utilizar la maquinaria de éstas
para multiplicarse. Los plásmidos y virus permiten introducir el gen de interés
en la célula huésped, por lo que se denominan moléculas transportadoras o vectores.
Enzimas de restricción
En general para introducir el gen de interés en el genoma de estos vectores se
utilizan las enzimas de restricción. Estas enzimas cortan los genomas en unas
secuencias específicas. Cortando el genoma huésped y el gen a insertar con las
mismas enzimas los extremos de ambos se vuelven "cohesivos". Esto es, se podrán
unir debido a la complementariedad de su bases. Después, gracias a otra enzima
denominada ligasa, se vuelven a unir las cadenas de los ácidos nucleicos quedando
insertado nuestro gen de interés en el lugar del genoma del vector que nos interese.
Células huésped
Una vez que el vector presente el gen de interés, se transfiere a la célula
huésped. Un buen organismo huésped debe caracterizarse por:
- Poder crecer rápidamente.
- Hacerlo de manera barata.
- Que sea fácilmente manipulable.
Hay tres tipos de células huésped: bacterias, especialmente cepas de Escherichia
coli, levaduras y ciertas células eucariotas como las líneas celulares derivadas
de algún mamífero. Cada uno de estos tipos celulares tiene sus ventajas e inconvenientes.
Las bacterias se caracterizan porque su material genético es muy simple, suelen
crecer muy rápido y las condiciones de crecimiento son bastante sencillas. Su
principal inconveniente es que no llevan a cabo algunas de las modificaciones
que sí realizan las células eucariotas en las proteínas, por ejemplo la glicosilación.
Las levaduras y las líneas celulares son más complicadas, especialmente estas
últimas, no crecen tan rápido y suelen ser más difíciles de tratar. No obstante,
la ventaja es que ambos sistemas pueden llevar a cabo modificaciones como las
descritas anteriormente.
Clonación
Una vez escogida la célula huésped se pone en contacto con el vector al
que se ha incorporado el gen de interés. Mediante diferentes técnicas se facilita
la entrada del vector en las células. A continuación hay que separar las células
que han incorporado el vector del resto. Una de las células modificadas se hace
crecer obteniéndose así múltiples células hijas que contienen el gen y que proceden
de una única célula inicial. Este proceso de seleccionar y hacer crecer una
única célula se denomina clonación. Las células hijas fabricarán todas sus proteínas
más la proteína extraña que se le ha introducido. La síntesis de la proteína
deseada por la célula huésped es lo que se conoce como expresión del gen de
dicha proteína. Cuantas más células huésped estén fabricando la proteína de
interés, mayor cantidad de dicha proteína se podrá obtener. Para ello el clon
de células huésped que mejor expresa el gen de la proteína de interés se selecciona,
se inocula a un fermentador o a botellas de cultivo- en función del tipo de
célula huésped- y se permite que las células crezcan ofreciéndoles las condiciones
más favorables de temperatura, humedad, nutrientes, etc.
 Tras obtener suficiente cantidad de proteína de interés, ésta se aísla a partir
del medio de cultivo en el que crecen las células o del interior de las propias
células dependiendo del tipo de células que se utilizan como sistema de expresión
y de cómo se haya diseñado el gen de dicha proteína. El aislamiento de una proteína
a partir de la mezcla de células, nutrientes y otras moléculas presentes en
el medio de cultivo es una tarea cuya puesta a punto puede ser compleja y que
requiere la aplicación de variadas técnicas bioquímicas de separación como las
cromatografías. En caso de que la proteína recombinante se vaya a utilizar como
medicamento, el paso siguiente es la formulación de la proteína purificada,
que es el proceso por el cual la proteína se preparará en su forma farmacéutica
definitiva que será la que le dará la máxima estabilidad y eficacia.
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