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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) |
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La reacción en cadena de la polimerasa, cuyas iniciales en inglés son PCR ("polymerase
chain reaction"), es una técnica que fue desarrollada por Kary Mullis a
mediados de los años 80. Con esta metodología se pueden producir en el laboratorio
múltiples copias de un fragmento de ADN específico, incluso en presencia de
millones de otras moléculas de ADN. Como su nombre indica, se basa en la actividad
de la enzima ADN polimerasa que es capaz de fabricar una cadena de ADN complementaria
a otra ya existente. Sus únicos requerimientos son que existan nucleótidos en
el medio que son la materia base para fabricar el ADN (los nucleótidos de adenina,
timina, citosina y guanina), y una pequeña cadena de ADN que pueda unirse a
la molécula que queremos copiar para que sirva como cebadora (el cebador, en
inglés "primer").
La reacción en cadena de la polimerasa se desarrolla en tres pasos. El primero
es la separación de las dos cadenas que forman la molécula de ADN que se quiere
amplificar, para lo cual se debe calentar el ADN a altas temperaturas que pueden
ser próximas a la ebullición. Cada una de estas cadenas actuará como molde para
fabricar su complementaria. A continuación se baja la temperatura para conseguir
que cada cebador se una a su región específica dentro de la cadena de ADN. El
último paso consiste en la generación de la cadena de ADN complementaria por
acción de la ADN polimerasa. El problema con el que se encontraron los científicos
que idearon esta técnica es que es preciso aumentar la temperatura de la mezcla
de reacción hasta valores por encima de los 70°C para que las dos cadenas de
ADN se separen. A estas temperaturas tan elevadas la ADN polimerasa se inactivaba
y era preciso añadirla de nuevo en cada ciclo. Esto fue así hasta que se descubrió
la bacteria Thermus aquaticus que vive en aguas termales y cuya ADN polimerasa
(Taq polimerasa) es capaz de trabajar a temperaturas superiores a los 70°C.
De esta manera sólo hay que añadir la enzima al inicio del proceso de reacción
y llevar a cabo tantos ciclos como sea necesario. Cada una de las moléculas
de ADN hijas pueden volver a entrar en el proceso y servir como molde para fabricar
más copias. Así tras 20 ciclos de reacción se puede obtener hasta 1 millón de
copias de una molécula de ADN.
La sensibilidad de la técnica de PCR es muy alta pero presenta algunos inconvenientes,
como son que no es una técnica cuantitativa y una relativamente alta probabilidad
de obtener falsos positivos por contaminación. Para solventar este último problema
se ha de optimizar la secuencia de los cebadores, así como la temperatura precisa
para que estos se unan al ADN en la localización correcta y realizar una adecuada
manipulación de los reactivos. Por otra parte para solventar el problema de
la cuantificación se han generado unas variaciones sobre el esquema inicial
de la PCR, dando lugar a lo que se conoce como PCR cuantitativa.
La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar en tiempo real
la amplificación de nuestro genoma de interés. Para llevar a cabo esta detección
existen varios métodos pero casi todos basados en la utilización de otro fragmento
de ADN (sonda) complementario a una parte intermedia del ADN que queremos amplificar.
Esta sonda lleva adherida una molécula fluorescente y otra molécula que inhibe
esta fluorescencia ("quencher"), de tal forma que sólo cuando la sonda es desplazada
de su sitio por acción de la ADN polimerasa la molécula fluorescente se libera
de la acción del "quencher" y emite fluorescencia al ser iluminada con un láser.
La cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR será
proporcional a la cantidad de ADN que se está amplificando. En general para
que sea válida esta técnica requiere realizar en paralelo una curva patrón en
las mismas condiciones para conocer la cantidad total de ADN que se está amplificando.
La técnica de la PCR ha sido vital para la secuenciación del genoma humano,
así como de todos los otros genomas secuenciados hasta el momento. Además, actualmente
existen muchas versiones comerciales de test basados en PCR para detectar agentes
infecciosos como Chlamydia trachomatis, el virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH) que causa el SIDA, Mycobacterium tuberculosis, y otros muchos.
El desarrollo de esta tecnología está siendo aplicado también en la exploración
de enfermedades genéticas (ej. la anemia de células falciformes o la fibrosis
quística), en pruebas para el cáncer (ej. para detectar recaídas tempranas),
y para determinar si dos individuos son compatibles genéticamente de cara a
un trasplante. La llegada de la PCR cuantitativa promete un gran avance en estos
test clínicos y de diagnóstico.
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